藥物的質(zhì)量控制包括生產(chǎn)過程以及終產(chǎn)品的質(zhì)量控制。重組蛋白藥物因其特殊的結(jié)構(gòu)通常需要哺乳動物表達(dá)體系制備，但由于其來源和生產(chǎn)工藝的特殊性，安全性需要額外關(guān)注。利用哺乳動物生產(chǎn)藥物的過程包括工程細(xì)胞的構(gòu)建及傳代擴(kuò)增、細(xì)胞培養(yǎng)、抗體純化和制劑。重組抗體藥物生產(chǎn)的質(zhì)量控制包括生產(chǎn)細(xì)胞的質(zhì)量控制和產(chǎn)品的質(zhì)量控制。
其中，細(xì)胞的質(zhì)量控制主要包括以下幾個方面：細(xì)胞鑒別、細(xì)菌和真菌檢測檢查、分支桿菌檢查、支原體檢查、外源因子和內(nèi)源因子的檢查、成瘤性/致瘤性檢查等。細(xì)胞庫是整個生產(chǎn)過程的原材料，監(jiān)管部門要求進(jìn)行全面的檢測。下圖為主細(xì)胞庫（MCB）的鑒定和檢測要求。
關(guān)于細(xì)胞庫檢定相應(yīng)的法規(guī)如下
必須證明用于生物制品生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)不含外源因子，包括支原體。支原體污染檢測必須在產(chǎn)品開發(fā)的各個階段進(jìn)行，包括原材料、細(xì)胞庫（MCB+WCB+EOPC）、病毒種子庫、未加工的收獲液和最終產(chǎn)品。
美國藥典＜USP＞63中指出需要用兩種方法檢測支原體污染：（A）瓊脂－肉湯培養(yǎng)法（B）指示細(xì)胞法。并提到經(jīng)驗證的核酸擴(kuò)增方法（NAT）或酶學(xué)方法可以用于檢測支原體，但前提是該方法經(jīng)驗證可與培養(yǎng)法和指示細(xì)胞法等效。
歐洲藥典EP2.6.7中也要求培養(yǎng)法和指示細(xì)胞法同時檢測，并且更詳細(xì)地介紹了NAT方法代替前1或2種方法的具體驗證要求。直接NAT法可以在有細(xì)胞毒性的材料中應(yīng)用或需要快速方法時使用。細(xì)胞培養(yǎng)富集后NAT方法適合于待檢樣品與指示細(xì)胞共培養(yǎng)一段時間后，從細(xì)胞和上清中提取核酸，再通過NAT檢測。
中國藥典3301指出主細(xì)胞庫、工作細(xì)胞庫、病毒種子批、對照細(xì)胞以及臨床治療用細(xì)胞進(jìn)行支原體檢查時，應(yīng)同時進(jìn)行培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA染色法）。病毒類疫苗的病毒收獲液、原液采用培養(yǎng)法檢查支原體；必要時，亦可采用指示細(xì)胞培養(yǎng)法篩選培養(yǎng)基。也可采用經(jīng)國家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的其他方法。
培養(yǎng)法
傳統(tǒng)的支原體檢測采用培養(yǎng)法，是將待測樣品接種到合適的液體培養(yǎng)基繁殖，然后再接種到固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一個月后觀察固體培養(yǎng)基中是否有“油煎蛋”菌落出現(xiàn)，如若有則證明該待測樣品被支原體污染。培養(yǎng)法是中國藥典收錄的方法，采用此方法可獲得比較可靠的數(shù)據(jù)。但培養(yǎng)法耗時長，且無法檢測到豬鼻支原體。
熒光染色法
熒光染色法是將樣品接種到專門的指示細(xì)胞中，培養(yǎng)一段時間后利用DNA熒光染料（例如Hoechst 33258）進(jìn)行染色，正常細(xì)胞核區(qū)見邊緣整齊清晰的熒光，胞質(zhì)區(qū)無熒光。支原體污染的細(xì)胞不僅在細(xì)胞核而且在細(xì)胞核外及細(xì)胞膜上均可見散在熒光。此方法同樣被中國藥典收錄，但是方法靈敏度低，重復(fù)性差，需要專門的指示細(xì)胞。
PCR法
PCR法則是通過設(shè)計相應(yīng)的引物，利用PCR儀擴(kuò)增對應(yīng)支原體的核酸序列，也可以在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)實時定量。此方法可實現(xiàn)快速檢測，通常只需要3小時，但是細(xì)胞培養(yǎng)液中的物質(zhì)會對PCR的擴(kuò)增過程產(chǎn)生影響
酶活法
酶活法是通過檢測支原體特異性ATP合成相關(guān)酶的活性間接反映支原體的含量，此方法的優(yōu)勢：
1）支原體識別率高，100多種支原體，只有1種不能識別，而這種支原體幾乎不會出現(xiàn)在體外的細(xì)胞中；
2）可以判斷出細(xì)胞的狀態(tài)；
3）不會造成假陽性或者假陰性；
4）檢測周期短；
劣勢：樣品基質(zhì)中的物質(zhì)可能會影響ATP酶活性，從而影響檢測結(jié)果。
自從首次在細(xì)胞培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)支原體污染以來，各國監(jiān)管部門始終關(guān)注這一影響生物制品安全性的因素。各國藥典或指南中詳細(xì)描述了幾種支原體的檢測方法，但是隨著生物制藥行業(yè)的快速發(fā)展和經(jīng)典方法的不足，一些新穎的方法也被作為替代或者補(bǔ)充方法廣泛使用。不同的方法靈敏度參差不齊，當(dāng)該方法用于質(zhì)量放行時應(yīng)被充分的驗證。
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參考文獻(xiàn)
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