內(nèi)毒素存在于革蘭氏陰性菌的外膜上，通過引發(fā)一系列免疫反應(yīng)對人體健康構(gòu)成威脅。因此，對其進(jìn)行準(zhǔn)確檢測至關(guān)重要。
內(nèi)毒素
內(nèi)毒素（化學(xué)上稱為脂多糖或 LPS）是一種固定在革蘭氏陰性菌外膜上的成分。它可以分為三部分：暴露于外部環(huán)境的雜多糖O-抗原、具有胞內(nèi)和胞外結(jié)構(gòu)域的核心寡糖以及細(xì)胞膜下方的脂質(zhì)A。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)，LPS 屬于兩親屬性。
內(nèi)毒素分子被脂質(zhì) A 錨定在細(xì)胞壁內(nèi)，但會不斷釋放到周圍的培養(yǎng)基中，不僅在細(xì)胞死亡時，而且在其生長和分裂過程中也是如此。一旦內(nèi)毒素進(jìn)入血液循環(huán)，免疫細(xì)胞對其進(jìn)行識別，就會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號通路的快速激活，從而釋放血管活性肽和細(xì)胞因子等促炎介質(zhì)。上述過程可能導(dǎo)致發(fā)熱、休克，甚至死亡。由于其在滅菌過程中對人體健康存在潛在危害且具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性，因此生物制品類、注射用藥劑、抗生素類、疫苗等制劑以及醫(yī)療器材類必須經(jīng)過細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)合格后才能使用。
內(nèi)毒素檢測的方法
多年來，用于檢測和量化內(nèi)毒素的測試方法不斷發(fā)展，以提高其靈敏度。鱟變形細(xì)胞裂解物 (LAL) 測定是內(nèi)毒素檢測的藥典測試。該測定的試劑是來自鱟 (Limulus) 變形細(xì)胞裂解物的凍干產(chǎn)物。除了 LAL 檢測外，Tachypleus（另一種鱟）變形細(xì)胞裂解物 (TAL) 檢測也被批準(zhǔn)用于內(nèi)毒素檢測。
此外，隨著重組C因子內(nèi)毒素檢測方案供應(yīng)商越來越多，法規(guī)也越來越明朗，因此被廣泛接受。其檢測原理更為明確，原料可控，因此被用于更為準(zhǔn)確的內(nèi)毒素含量檢測，成為傳統(tǒng)鱟試劑檢測的補(bǔ)充或替代方法。
無論哪種內(nèi)毒素檢測方法，整個檢測體系正常工作的最重要的條件在于內(nèi)毒素分子本身、酶、檢測樣品屬性以及其他條件和諧共處，這些因素如果出現(xiàn)狀況都會導(dǎo)致內(nèi)毒素檢測產(chǎn)生抑制或增強(qiáng)作用，統(tǒng)稱干擾，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。
但是......不要怕，實(shí)驗(yàn)前，做到知己知彼，方能百戰(zhàn)百勝！
我們來看看到底都有哪些會是內(nèi)毒素檢測的干擾因素。
首先，做實(shí)驗(yàn)的時候不淡定是最大的干擾因素，開個玩笑......
言歸正傳，真正的干擾一般來源于如下幾個方面：
1、內(nèi)毒素的自身屬性
? 內(nèi)毒素分子本身是兩親性的分子。兩親性導(dǎo)致內(nèi)毒素會在水相中聚集分布，內(nèi)部疏水，外部親水。文獻(xiàn)表明聚集體太大不利于內(nèi)毒素活性顯現(xiàn)，單體分布也不利于活性呈現(xiàn)。聚集-分散是一個動態(tài)過程，受到二價金屬離子（Ca2+，Mg2+）和pH（H+）、非離子型去垢劑影響；
? 負(fù)電荷基團(tuán)（PO43-，糖基）在一定條件下也會和正電荷位點(diǎn)或者陽離子相互結(jié)合。
2、樣品環(huán)境，如溫度，pH, 去垢劑，二價金屬離子，滲透壓等
? 低pH下，質(zhì)子會和二價陽離子競爭，打破聚集體動態(tài)平衡；
? 二價金屬離子（Ca2+,Mg2+）促進(jìn)鹽橋形成而促進(jìn)LPS聚集，因此內(nèi)毒素檢測會受到金屬離子螯合劑干擾，EDTA有六個金屬離子配位點(diǎn)，因此干擾最強(qiáng)，其次是檸檬酸；
? 由于去垢劑也有兩親性，可能會取代內(nèi)毒素并形成占位效應(yīng)，導(dǎo)致聚集體組成變化形成干擾，其中PS-20擴(kuò)散比PS-80快，因此PS-20干擾更大；
? 低溫下（2-8℃或-20℃）聚集體形成較慢，同時非離子型去垢劑占位形成內(nèi)毒素-去垢劑復(fù)合體的速度也比較慢，因此干擾會比較低；
? 過高濃度的鹽或糖溶液（如50%的葡萄糖或5%的氯化鈉溶液）通常會抑制試劑反應(yīng)。因?yàn)楦邼B透壓的溶液會從試劑吸水，從而使酶失活，造成抑制；
LPS聚集狀態(tài)動態(tài)圖（Johannes Reich et al., 2016）
3、樣品屬性，如電荷，親水或疏水特性
? 正電荷蛋白結(jié)合內(nèi)毒素負(fù)電荷位點(diǎn)。在陽離子蛋白溶菌酶、核糖核酸酶A 和人IgG樣品內(nèi)毒素檢測中，發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)對內(nèi)毒素的掩蓋，即使對樣品進(jìn)行稀釋也無法解決。
? 蛋白和內(nèi)毒素疏水相互作用，包裹內(nèi)毒素導(dǎo)致活性無法檢測
4、其他干擾成份（蛋白酶，抑制劑，復(fù)雜成份、佐劑）
? pH值在6～8范圍酶活性最佳，因此樣品pH值盡量不能低于5不能高于9；
? 高濃度變性劑會使得蛋白（酶）變性，喪失活性；
? 如反應(yīng)體系中有蛋白酶，也會因?yàn)榻到饣钚晕镔|(zhì)，如C因子，導(dǎo)致檢測受到干擾，結(jié)果不準(zhǔn)確；
? 絲氨酸蛋白酶抑制劑會抑制C因子底物酶切活性，干擾檢測；
? 血清中復(fù)雜成份干擾等；
? 疫苗領(lǐng)域常會遇到的氫氧化鋁佐劑吸附內(nèi)毒素導(dǎo)致檢測干擾問題。
以上只是把可能的干擾條件列舉出來，我們真正在樣品內(nèi)毒素檢測中，能夠同時遇到2個以上問題就算中獎了。所以，我們要做的事情是，在遇到干擾的時候，理性分析樣品屬性，看看可能會是什么原因，然后對癥下藥，便可解決。
下一期，我們再看看以上問題可以如何解決，敬請期待…….
[1] Rui xuan Bu, Xinren Deng, Yuan Cao.Effect of different sample treatment methods on Low Endotoxin Recovery Phenomenon, Journal of Microbiological Methods,Volume 186, July 2021, 106241.
[2] Yuan Cao. Low endotoxin recovery and its impact on endotoxin detection, Biopolymers, Volume112, Issue11 November 2021
[3] Johannes Reich, Pierre Lang. Masking of endotoxin in surfactant samples: Effects on Limulus-based detection systems, Biologicals Volume 44, Issue 5, September 2016, Pages 417-422
[4] PDA Technical Report No. 82 (TR 82) Low Endotoxin Recovery, PDA, 2019.